2026年6月19日，深圳湾实验室化学与生物学研究所李刚课题组在Nature Communicaions 发表了题为“Scaling Covalent Ligand Discovery through Dynamic Combinatorial Library-versus-Proteome Screening”的研究论文。该研究将动态组合化学（dynamic combinatorial chemistry, DCC）与活性导向蛋白质组学（activity-based protein profiling, ABPP）相结合，建立了“分子库对蛋白质组”（library-versus-proteome）的高通量筛选平台，无需预先合成大量纯分子的前提下，在复杂生物体系中实现共价配体的实时筛选与优化。该平台显著提升了筛选通量，突破了传统基于质谱的化学蛋白质组学依赖单个化合物逐一筛选、且需要预先合成完整化合物库的限制，为面向蛋白质组的大规模共价配体发现提供了新策略。

小分子化学探针是解析蛋白质功能和推动药物发现的重要工具。然而，目前人类蛋白质组中只有少数蛋白拥有高质量化学探针，许多重要但“难成药”的蛋白仍缺乏有效靶向手段。近年来，基于质谱的化学蛋白质组学，尤其是ABPP技术，因能够在天然生物体系中无偏倚地评估小分子的作用强度和选择性，已成为共价配体发现的重要平台。但这一方法通常需要对预先合成的候选化合物逐个筛选，通量有限，也限制了更大化学空间的探索。

为解决这一问题，作者引入动态组合化学策略，通过可逆化学反应使不同分子片段在体系中动态交换和重组，当蛋白质作为模板存在时，更适合结合靶标的分子会被优先富集。课题组据此将DCL与ABPP联合，提出一种机制驱动的“分子库对蛋白质组”筛选策略：一方面利用DCL在复杂体系中原位生成小分子库，另一方面借助ABPP在蛋白质组尺度上读取这些分子与靶标之间的相互作用。与传统方法相比，该平台将筛选通量提高了20倍，并实现了“先筛选、后合成”的研究范式，仅对筛出的活性分子进行后续合成与验证即可，大幅降低了化学合成负担。

首先，作者在丝氨酸水解酶家族中验证了该策略的有效性。研究团队设计了能够与醛片段发生可逆反应的亲电warhead，并与片段醛库原位构建动态分子库，通过与丝氨酸水解酶家族探针竞争实现蛋白质组范围内的抑制剂筛选。研究成功发现了PPME1、ABHD11和PNPLA6等丝氨酸水解酶的选择性共价抑制剂。其中，针对PNPLA6的特异性抑制剂此前尚未见报道。借助该抑制剂，作者进一步结合脂质组学分析，系统拓展了PNPLA6的内源性底物谱，发现其不仅能够水解LPC，还作用于LPE、LPI等多种溶血磷脂，并揭示PNPLA6参与细胞脂质代谢调控和癌细胞增殖过程。

在此基础上，作者进一步将该平台拓展到氨基酸残基水平即靶向半胱氨酸的共价配体发现，发展出第二代DCL-ABPP策略。不同于传统竞争型ABPP难以在大规模位点层面解析复杂混合物中单个配体的活性，本研究设计了同时带有反应基团和炔基标签的动态分子库成员，使其与半胱氨酸结合后可直接通过点击化学富集并由质谱解析修饰位点并且通过半胱氨酸修饰的偏移分子量直接抓取有效分子的具体信息，相比于第一代DCL-ABPP节省了确认有效配体的凝胶分析环节。结合基于TMT标记的定量蛋白质组学，研究团队在仅8次质谱分析中完成了80种候选分子的同时筛选，获得了2627个“可配体化”半胱氨酸位点及其表观EC50数据，建立了大规模半胱氨酸共价配体图谱。

基于该图谱，研究团队发现了多个蛋白的选择性共价配体，包括NIT2、PRDX5、TXNDC17、RPS6KA1和VCP蛋白等，其中多数蛋白此前缺乏已知抑制剂。作者对部分配体进行了进一步功能验证，证实这些分子不仅能够特异性标记相应蛋白的关键半胱氨酸位点，还能有效调控其酶学活性或细胞功能。例如，针对PRDX5的配体可显著影响线粒体中过氧化氢代谢，证明该平台筛的分子具有良好的功能探针潜力。

随后，作者聚焦VCP蛋白（稳态调控关键ATP酶），利用靶向共价配体研究其生物学功能。研究发现，筛选获得的半胱氨酸靶向配体G2-369可高效结合VCP蛋白并抑制其酶活，在癌细胞中诱导明显的细胞毒性。进一步结合BONCAT新生蛋白质组学分析，作者验证出VCP蛋白C522位点抑制会激活内质网应激-未折叠蛋白反应（ER stress-UPR）通路，并新揭示了GPCR信号与ER应激之间此前未被报道的串扰机制。研究表明，GNG4蛋白在这一过程中参与调控PERK和ATF4信号激活，提示VCP介导的细胞死亡不仅依赖经典的应激反应轴，也与GPCR/ERK信号分支密切相关。

最后，作者进一步利用已发现的VCP蛋白配体（G2-369）作为竞争探针，建立了基于凝胶的快速竞争型DCL-ABPP优化流程，对403种商业醛片段与2种warhead构成的806个理论候选分子进行了高通量筛选，并在2天内完成快速筛选，发现更高活性的VCP蛋白抑制剂compound 95。体外实验表明，compound 95在纯化VCP蛋白酶活抑制实验中表现出纳摩尔级活性，在裂解液和活细胞中也均展现出优于先导分子G2-369的抑制效果；在HT29和AMO1肿瘤细胞中，compound 95的抗增殖活性同样明显增强，其中在部分细胞中的活性可达到78.9 nM。进一步地，作者在HT29结直肠癌皮下移植瘤小鼠模型中评估了compound 95的体内抗肿瘤效果：当肿瘤体积生长至约100 mm³后，对照组给予溶剂处理，实验组以 5 mg/kg 剂量腹腔注射compound 95，每周给药3次，持续21天。结果显示，与对照组相比，compound 95能够显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积和终点肿瘤重量，表明其具有良好的体内抗肿瘤活性。这一结果说明，该平台不仅适用于初始命中化合物发现，也能够进一步加速先导分子的优化迭代，并推动活性分子向体内功能验证和潜在先导药物开发迈进。

综上所述，该研究建立了一种兼具高通量、低合成需求和蛋白质组尺度解析能力的“分子库对蛋白质组”筛选平台，系统推进了丝氨酸水解酶家族和半胱氨酸位点的靶向共价配体发现与优化。该工作不仅为难成药蛋白的化学探针开发提供了新技术路线，也为研究蛋白功能、靶点发现和共价药物先导分子提供了通用策略。

李刚研究员，陈立教授，李笑宇教授和何春茂教授为该论文的共同通讯作者，黄渝晨、侯乐璇、何瑞平和朱琳为论文共同第一作者。该研究得到了深圳湾实验室多组学质谱平台、生物影像平台、基因组学平台、生化分析平台的支持，研究工作得到了国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年科学基金项目（B 类）（原优秀青年科学基金项目）的资助。

李刚课题组（http://chemoproteomics-lab.szbl.ac.cn/）目前的研究方向包括：1）开发邻近标记、化学交联质谱等蛋白质组学平台，进行蛋白蛋白相互作用研究，鉴定泛素连接酶以及去泛素化酶的作用底物，探索肿瘤治疗的泛素化修饰蛋白新靶点。2）开发功能氨基酸的全蛋白质组修饰方法，为无法成药蛋白寻找新的共价配体，并利用配体研究RNA结合蛋白的功能。3）开发“分子库-对-分子库”筛选平台，以超高通量快速筛选蛋白酶的抑制剂分子，以及靶向功能氨基酸的共价配体。课题组常年招聘博士后、联培博士研究生加入，共同探究功能蛋白质组学的研究前沿，请有意者发送简历ligang@szbl.ac.cn 。

论文标题：

Scaling Covalent Ligand Discovery through Dynamic Combinatorial Library-versus-Proteome Screening

供稿 | 李刚课题组

编辑 | 鲍 啦

责编 | 远 山

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